关于oligo引物设计

你直接可以用NCBI提供的免费设计软件http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/在最上面的大空格输入你的目标序列，或者直接输入ncbi的基因号也可以。

然后到最下面点击“Get Primers＂就可以了。

等你熟练后，再可以慢慢练习调整那些参数。

至于如何找基因，你到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore在最上面的空格输入基因名称 就可以了。

各种引物探针设计软件计算出来的Tm值该怎么考虑？相差太大。

如...

miRNA的RT引物设计比较困难，主要是他短，没什么很好的软件。

如果做得少不如买试剂盒，虽然贵，但省时省力可靠。

如果要自己弄，可以设计茎环引物反转录；或者对rna加polyA，同含聚T的引物反转，如同oligo-dT；或者用带通用tag的部分互补引物反转，等等。

但自己设计肯定要优化，试验次数多，耗时耗力耗钱。

关于设计引物

酶切位点的保护碱基基本是大家常用以及默认的。

Kpn1为：GGGTACCC 、GGGGTACCCC、CGGGGTACCCCG 三个，长度你可以根据你的引物来选择。

Xba1为：CTCTAGAG 、GCTCTAGAGC 、TGCTCTAGAGCA 、CTAGTCTAGACTAG。

具体要你自己来选择哪一个。

比如退火温度，GC比值等等。

保护碱基资料上都有，常见的酶切位点都有保护碱基。

设计引物你可以用primer5和Oligo6软件来设计，参数全部都能算出来，包括发夹结构。

你也可以定点突变来引入你的酶切位点，但是也很麻烦。

其他的方法还有甲基化筛选等等，我就不是很熟悉了。

实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求

展开全部 参照以下real-time PCR引物设计原则：1.最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.2.产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）.3.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大.4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳.5.碱基要随机分布，尽量均匀.6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.8.引物5′端可以修饰.9.3'端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）.10.引物3′端要避开密码子的第3位.11.引物整体设计自由能分布5'端大于3'端，且3'端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区.14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源.15.查看有无假基因的存在.假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似.16.TM值在55-63度之间.17..引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源....

引物的TM值如何计算

参照以下real-time PCR引物设计原则：1.最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。

3.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

9. 3'端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5'端大于3'端，且3'端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无假基因的存在。

假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

16.TM值在55-63度之间。

17. .引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。

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